Từ cấu trúc lỗ đồng đều đến dung lượng liên kết IgG cao hơn màng PVDF thương mại

Màng sắc ký giúp rút ngắn quãng đường khuếch tán và vận hành ở chênh áp thấp hơn cột hạt nhồi. Điểm hạn chế thường gặp là diện tích bề mặt và mật độ phối tử thấp, khiến dung lượng liên kết của màng chưa đạt mức mong muốn. Nghiên cứu này tiếp cận vấn đề từ cấu trúc nền: tạo một màng có lỗ đồng đều, độ rỗng cao và các lỗ nối thông ba chiều, sau đó đánh giá màng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng IgG4 bằng sắc ký tương tác kỵ nước.

 

 

Hình tóm tắt. Quy trình tạo màng ICC từ khuôn hạt silica, cơ chế nạp và giải hấp IgG trong sắc ký màng tương tác kỵ nước, cùng kết quả so sánh dung lượng liên kết với màng PVDF thương mại.

 Vì sao cấu trúc màng quan trọng

Trong cột sắc ký hạt nhồi, chất tan phải khuếch tán vào hệ lỗ bên trong hạt trước khi tiếp cận vị trí liên kết. Quá trình này làm chậm truyền khối, đồng thời cột có thể chịu chênh áp lớn khi vật liệu biến dạng hoặc lỗ bị tắc. Với màng vi lọc dùng làm chất mang sắc ký, dòng đối lưu đưa protein đi qua lỗ màng và tới bề mặt liên kết nhanh hơn. Tuy nhiên, nếu màng có phân bố kích thước lỗ rộng hoặc diện tích bề mặt thấp, ưu thế truyền khối chưa chuyển thành dung lượng hấp phụ cao.

Trong sắc ký tương tác kỵ nước, bài báo thay hạt nhựa bằng màng vi lọc nhưng giữ nguyên cơ chế liên kết. IgG được nạp trong đệm muối cao và giải hấp bằng đệm muối thấp. Khi dung dịch đi xuyên qua hệ lỗ, protein tiếp cận bề mặt bằng dòng đối lưu thay vì phải khuếch tán sâu vào hạt nhồi. Màng vì thế cần có đủ diện tích liên kết mà vẫn duy trì đường dòng thông suốt.

 Ba kết quả nổi bật

· Màng ICC chế tạo từ hạt silica 440 nm có diện tích bề mặt BET 27,77 m²/g, so với 2,21 m²/g của màng PVDF 0,45 µm.

· Dung lượng liên kết IgG cao nhất đạt 25,5 mg/mL màng, xấp xỉ 10 lần mức 2,5 mg/mL của PVDF thương mại.

· Trong các phép thử, chênh áp qua màng luôn dưới 40 kPa; đỉnh giải hấp sắc cho thấy ảnh hưởng của khuếch tán chậm trong lỗ là không đáng kể.

Tạo khuôn tinh thể keo bằng phương pháp buồng thẳng đứng

Hạt silica đơn phân tán được tổng hợp theo phương pháp Stöber. Đường kính trung bình của các mẻ nằm trong khoảng 300–500 nm; trong mỗi mẻ, độ lệch chuẩn của phân bố kích thước nhỏ hơn 5% đường kính trung bình. Huyền phù hạt trong ethanol được đưa vào buồng tạo bởi hai tấm kính và hai miếng đệm polymer. Khi ethanol bay hơi, lực mao dẫn vận chuyển hạt lên vùng tạo màng và các hạt tự sắp xếp thành cấu trúc xếp chặt.

Quy trình tổng hợp dùng 210 mL ethanol, 17 mL nước chuẩn HPLC, 11 mL amoni hydroxide và 11 mL TEOS. Hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ dưới khuấy. Hạt được ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút và rửa ba lần bằng ethanol/nước 50:50 theo thể tích. Để tạo hạt lớn hơn, nhóm nghiên cứu bổ sung thêm 11 mL TEOS và 10 mL nước sau chu kỳ đầu, rồi lặp lại phản ứng 4 giờ đến khi đạt kích thước mong muốn. Huyền phù cuối được pha về 1–5% khối lượng trong ethanol tuyệt đối.

Buồng thẳng đứng gồm hai lá kính phủ 24 × 30 mm, ngăn cách bằng các dải Mylar hoặc màng vi lọc. Độ dày miếng đệm quyết định độ dày khuôn và màng ICC. Màng vi lọc giúp ethanol thoát nhanh hơn nên rút ngắn quá trình tự sắp xếp so với Mylar. Tùy nồng độ hạt, khuôn hình thành trong khoảng một ngày và được sấy 12 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi thấm monomer.

 

Hình 1. Quá trình tạo khuôn tinh thể keo từ hạt silica 375 nm: (A) buồng thẳng đứng dùng cho quá trình tự sắp xếp; (B) khuôn sau khi dung môi bay hơi; (C) ảnh TEM của hạt silica; (D) ảnh FESEM của khuôn tinh thể keo. Hình được giữ nguyên từ bài báo gốc.

 Khuôn hình thành trong khoảng một ngày, tùy nồng độ hạt silica. Độ dày khuôn, và sau đó là độ dày màng, được điều chỉnh bằng độ dày của miếng đệm. Sau khi tạo khuôn, mẫu được sấy ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ trước bước thấm monomer.

Ảnh TEM cho thấy các hạt 375 nm có dạng cầu và tương đối đồng đều. Ảnh FESEM ghi nhận các miền xếp chặt tâm mặt, là điều kiện để sau bước loại silica có thể thu được hệ lỗ lặp lại và thông nhau.

Biến khuôn hạt thành mạng lỗ thông ba chiều

Khuôn silica được thấm bằng hỗn hợp gồm 0,5 g HEMA, 1,5 g HBMA, 0,2 g EGDMA và 0,03 g chất khơi mào quang BIE. Hỗn hợp được trùng hợp dưới đèn UV 30 W, bước sóng 254 nm, trong 15 phút. Sau đó, khuôn silica được hòa tan bằng dung dịch HF 10% khối lượng, để lại màng tinh thể keo nghịch đảo (inverse colloidal crystal, ICC).

 

Hình 2. Chế tạo màng ICC từ khuôn hạt silica 375 nm: (A) thấm monomer và quang trùng hợp; (B) loại hạt silica để tạo màng; (C) ảnh FESEM của khuôn đã được thấm monomer sau trùng hợp; (D) ảnh FESEM của màng ICC sau khi loại khuôn. Hình được giữ nguyên từ bài báo gốc.

 Điều thu được sau bước loại khuôn

Các vị trí ban đầu do hạt silica chiếm giữ trở thành lỗ rỗng. Những điểm tiếp xúc giữa các hạt tạo thành các cửa nối giữa lỗ, vì vậy dòng chất lỏng không chỉ đi qua các khoang riêng lẻ mà có thể di chuyển trong một mạng liên thông theo ba chiều. Ảnh FESEM cho thấy cấu trúc tương đối đồng đều và chỉ có ít lỗ bị bít.

Màng tạo từ hạt 440 nm có mật độ lỗ lớn hơn mẫu tạo từ hạt 835 nm. Ảnh mặt cắt cho thấy mạng lỗ tiếp tục qua chiều dày màng, trong khi PVDF thương mại có lỗ ngẫu nhiên và phân bố kích thước rộng hơn. Phép đo BET xác nhận khác biệt về bề mặt: mẫu ICC 440 nm đạt 27,77 m²/g, cao hơn khoảng 12,6 lần giá trị 2,21 m²/g của PVDF 0,45 µm.

Cách thiết kế này đồng thời nhắm tới hai yêu cầu thường xung đột: tăng diện tích bề mặt để protein có nhiều vị trí tiếp xúc, nhưng vẫn duy trì đường dòng thông thoáng để hạn chế chênh áp.

 So sánh hình thái màng ICC và màng PVDF thương mại

Các màng ICC tạo từ hạt silica 440 và 835 nm được so sánh với màng PVDF vi lọc có kích thước lỗ danh định 0,45 µm. Ảnh bề mặt và mặt cắt cho thấy màng ICC có cấu trúc lỗ đều và liên thông rõ rệt, trong khi PVDF có mạng lỗ ngẫu nhiên với phân bố kích thước rộng hơn.

 

Hình 3. Ảnh FESEM: màng ICC từ hạt silica 440 nm, bề mặt (A) và mặt cắt (B); màng ICC từ hạt 835 nm, bề mặt (C) và mặt cắt (D); màng PVDF thương mại, bề mặt (E) và mặt cắt (F). Hình được giữ nguyên từ bài báo gốc.

 Khi kích thước lỗ giảm trong một vật liệu có độ rỗng tương đương, số lỗ trên một đơn vị thể tích tăng và diện tích bề mặt nội tại cũng tăng. Phép đo BET cho thấy màng ICC từ hạt 440 nm đạt 27,77 m²/g, cao gấp khoảng 12,6 lần giá trị 2,21 m²/g của PVDF 0,45 µm. Chênh lệch này giải thích vì sao cấu trúc ICC có thể cung cấp nhiều diện tích tiếp xúc hơn cho IgG.

 Thử nghiệm sắc ký màng tương tác kỵ nước với IgG4

Màng ICC được lắp vào hệ ÄKTA FPLC và thử với kháng thể đơn dòng IgG4 có khối lượng phân tử 155 kDa. Dung dịch đệm nền là phosphat natri 20 mM, pH 7,0; đệm nồng độ muối cao chứa thêm amoni sulfat 2 M. Dòng nạp là IgG 1 g/L trong đệm muối cao. Toàn bộ dung dịch được lọc trước qua màng 0,22 µm.

· Cân bằng màng trong 30 phút ở 1 mL/phút, sau đó bơm 2,5 mL đệm muối cao.

· Nạp 10 mL dung dịch IgG ở 1 mL/phút và rửa bằng 7,5 mL đệm muối cao.

· Giải hấp IgG bằng đệm nồng độ muối thấp; lưu lượng ở bước rửa và giải hấp vẫn là 1 mL/phút.

Sắc ký đồ gồm bốn giai đoạn: cân bằng bằng 2,5 mL đệm muối cao, nạp 10 mL dung dịch IgG, rửa bằng 7,5 mL đệm muối cao không chứa IgG và giải hấp bằng đệm muối thấp. Trình tự này tách phần protein không được giữ lại khỏi phần được thu hồi khi đổi đệm. Các vật liệu đều được thử ở 1 mL/phút, cho phép so sánh trực tiếp vị trí điểm xuyên thấu và dạng đỉnh giải hấp.

 

Hình 4. Tín hiệu hấp thụ UV theo thể tích dịch đi qua màng: (A) màng ICC từ hạt silica 440 nm; (B) màng ICC từ hạt 835 nm; (C) màng PVDF thương mại. Các đường được dịch theo phương thẳng đứng để dễ quan sát. Hình được giữ nguyên từ bài báo gốc.

 Điểm xuyên thấu (breakthrough) chuyển về phía thể tích lớn hơn theo thứ tự PVDF, ICC 835 nm và ICC 440 nm. Điều đó phù hợp với xu hướng tăng diện tích bề mặt nội tại khi kích thước lỗ giảm. Cả ba màng đều cho đỉnh giải hấp sắc; theo phân tích của bài báo, dạng đỉnh này cho thấy quá trình không bị chi phối đáng kể bởi khuếch tán chậm trong lỗ.

 Hiệu năng định lượng và ý nghĩa của kết quả

Bảng 1. Độ thấm và dung lượng liên kết bão hòa IgG của các màng

 Đánh đổi giữa độ thấm và dung lượng

Màng có lỗ lớn hơn cho độ thấm cao hơn: giá trị tăng từ 5,0 lên 13,0 L·m⁻²·h⁻¹·kPa⁻¹ khi kích thước hạt tạo khuôn tăng từ 375 lên 835 nm. Đổi lại, dung lượng liên kết IgG giảm từ 25,5 xuống 9,5 mg/mL. Màng PVDF đạt độ thấm 10,3 L·m⁻²·h⁻¹·kPa⁻¹ nhưng chỉ liên kết 2,5 mg IgG/mL màng. Với mẫu ICC 375 nm, dung lượng cao hơn PVDF khoảng 10 lần; mẫu 440 nm cao hơn 7,6 lần.

Độ thấm không phản ánh đầy đủ hiệu năng hấp phụ. Mẫu ICC 835 nm có độ thấm cao nhất nhưng dung lượng thấp hơn hai mẫu lỗ nhỏ; mẫu 375 nm cho xu hướng ngược lại. Chênh áp của mọi phép thử vẫn dưới 40 kPa, nên việc tăng diện tích bề mặt chưa làm mất ưu thế vận hành ở vùng áp suất thấp của màng vi lọc. Kích thước lỗ phù hợp vì thế phụ thuộc vào sự cân bằng giữa dung lượng cần đạt và năng suất dòng của quy trình.

 Kết luận

Kết quả cho thấy dung lượng của màng sắc ký có thể được cải thiện mạnh bằng cách thiết kế hình học lỗ, thay vì chỉ dựa vào hóa học bề mặt. Mạng lỗ ICC đồng đều và liên thông tạo diện tích bề mặt lớn, trong khi chênh áp trong thí nghiệm vẫn dưới 40 kPa. Đây là cơ sở để phát triển màng hấp phụ có dung lượng cao cho tinh sạch protein.

Nền ICC cũng có thể được chức năng hóa cho các cơ chế sắc ký khác, chẳng hạn gắn nhóm trao đổi ion hoặc ghép chuỗi polymer để điều chỉnh kích thước lỗ. Tuy vậy, bài báo mới đánh giá một kháng thể mô hình và vận hành ở quy mô phòng thí nghiệm; độ bền dài hạn, khả năng tái sử dụng và hiệu năng với dòng nguyên liệu phức tạp cần được kiểm chứng trong các nghiên cứu tiếp theo.

 

TS. Vũ Tuấn Anh-Bộ môn Công Nghệ Vật Liệu